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carbonato per valutare i requisiti metalloenzimatici dei microbi coinvolti nell'ossidazione anaerobica del metano (AOM).Abbiamo misurato isotopi stabili, oligoelementi, biomarcatori lipidici e DNA genomico e i risultati indicano il predominio dei biomarcatori lipidici correlati all'AOM nei campioni di carbonato studiati, nonché un'occorrenza predominante degli archaea metanotrofici anaerobici (ANME) -1.Riportiamo anche prove di significativi arricchimenti preferenziali di vari oligoelementi (Li, Ni, Co, Cu, Zn e Mo) nelle frazioni lipidiche totali dei carbonati CB, rispetto alle composizioni elementari determinate per le corrispondenti frazioni di carbonato, che differiscono da quelle precedentemente segnalato per altri siti di filtrazione.Ipotizziamo che gli arricchimenti di oligoelementi nelle frazioni lipidiche ospitate da carbonati possano variare a seconda del tipo di assemblaggio microbico AOM.È necessario un ulteriore lavoro per studiare ulteriormente i meccanismi degli oligoelementi legati ai lipidi nei carbonati di filtrazione fredda come potenziali metalloenzimi nell'AOM.Le infiltrazioni di freddo si verificano ai margini degli oceani in tutto il mondo1,2, corrispondenti a emanazioni di fluidi ricchi di metano dal fondale marino nella colonna d'acqua3,4.I tassi di infiltrazione dei fluidi ridotti possono variare sostanzialmente sul fondo del mare5, portando a un ampio spettro di condizioni redox nei sedimenti sotterranei alle infiltrazioni fredde6.Un processo biogeochimico chiave nelle infiltrazioni di metano sottomarino è l'ossidazione anaerobica del metano (AOM), che consuma in modo efficiente una frazione sostanziale del metano rilasciato nella colonna d'acqua sovrastante7,8.Durante l'AOM, i livelli di alcalinità aumentano fortemente nelle acque interstiziali circostanti a causa della produzione di biocarbonato (HCO3−), favorendo la sovrasaturazione e la precipitazione del carbonato2,9.Di conseguenza, la precipitazione di carbonato autogeno si incontra tipicamente nelle infiltrazioni fredde10,11, che possono fungere da archivio per indagare sugli eventi di rilascio di metano nelle infiltrazioni sia moderne che antiche12,13.L'AOM è tipicamente mediata da un consorzio di archei metanotrofi anaerobici (ANME) e batteri che riducono i solfati (SRB)14,15.Tuttavia, studi recenti hanno anche riportato che gli ANME possono anche utilizzare altri accettori di elettroni, come ossiidrossidi ricchi di manganese (Mn) e ferro (Fe), per promuovere l'ossidazione del metano nelle infiltrazioni fredde16.In particolare, altri metalli in traccia come nichel (Ni), cobalto (Co), molibdeno (Mo), tungsteno (W) e zinco (Zn) possono anche essere coinvolti nell'AOM, agendo come cofattori enzimatici17,18.La maggior parte di questi risultati sono stati ottenuti da esperimenti colturali17,19.Uno studio recente ha caratterizzato, per la prima volta, la geochimica degli oligoelementi delle frazioni lipidiche totali conservate nei carbonati autogenici provenienti da varie infiltrazioni in tutto il mondo, come il Congo, le acque profonde del Nilo e le gorgonie del Niger e il Golfo del Messico20, suggerendo che un tale approccio potrebbe essere utilizzato per identificare tracce di metalli essenziali per l'attività microbica nelle infiltrazioni fredde.Uno studio precedente ha riportato un marcato arricchimento di Ni, Co, Mo e W nelle frazioni lipidiche ospitate da carbonati, che erano collegate a percorsi enzimatici precedentemente identificati coinvolti nell'AOM20.Tuttavia, le informazioni su come l'AOM possa essere influenzata dai cambiamenti nella biodisponibilità dei metalli in tracce nelle infiltrazioni fredde rimangono scarse.Recentemente, sono state scoperte strutture di cumuli di idrati di gas nelle Chukchi Borderlands (CB) dell'Oceano Artico occidentale21.Le informazioni geochimiche sull'origine del gas emesso e sulle proprietà del fluido dei pori sono state ottenute all'interno di questa struttura a tumulo durante la spedizione R/V ARAON ARA09C nel 201822. Tuttavia, finora, le firme biogeochimiche conservate nei carbonati autigeni non sono state studiate in questi gas appena scoperti cumuli di idrati.In questo studio, forniamo una caratterizzazione geochimica dettagliata di una serie di campioni di carbonato autogenico utilizzando isotopi e mineralogia stabili dell'ossigeno e del carbonio, nonché abbondanze di oligoelementi, biomarcatori lipidici e acidi nucleici.Gli obiettivi principali di questo studio erano i) valutare i fattori ambientali chiave che controllano la precipitazione dei carbonati nei cumuli di CB, ii) caratterizzare le caratteristiche geochimiche e della comunità microbica nei cumuli di CB e iii) valutare la relazione dei metalli in traccia nell'attività microbica associata all'AOM confrontando i nostri nuovi dati per le firme geochimiche e microbiche dei CB con quelli ottenuti in precedenza in altre infiltrazioni in tutto il mondo20.Abbiamo mirato a testare l'ipotesi che specifici arricchimenti di oligoelementi nelle frazioni lipidiche totali estratte da carbonati autogeni potrebbero essere indicativi di un utilizzo preferenziale di metalli in tracce da parte di diverse comunità ANME.Il nostro studio getta nuova luce sui requisiti metalloenzimatici dei microbi coinvolti nell'AOM.I campioni di carbonato autogenico raccolti in questo studio (Fig. 1, vedi anche Fig. S1 nelle Informazioni supplementari) erano dominati dalla calcite, con un contributo minore dalla dolomite (Tabella 1).I valori δ13C dei carbonati (δ13Ccarbonato) erano esauriti, variando tra − 37,0 e − 32,8‰.I valori δ18O dei carbonati (δ18Ocarbonato) variavano da 3,9 a 5,6‰, con valori più arricchiti che si verificano nei campioni degli strati di sedimenti più profondi (Tabella 1).I valori misurati di δ13Ccarbonato e δ18Ocarbonato di carbonati CB sfusi si sovrapponevano parzialmente a quelli determinati per una serie di campioni di filtrazione di carbonato precedentemente studiati20 (Tabella 1 e Fig. S210,23,24,25,26,27).Mappa che mostra (a) le strutture a tumulo scoperte nelle Chukchi Borderlands (CB) con carbonati autogeni studiati in questo studio e (b) quattro siti di studio di confronto: Congo fan (CF), Nile deep-sea fan (NDSF), Niger fan ( NF) e Golfo del Messico (GoM).La mappa batimetrica è stata generata con la Carta batimetrica internazionale dell'Oceano Artico versione 3.0 (https://www.ngdc.noaa.gov/mgg/bathymetry/arctic).L'immagine del profilo inferiore (SBP) è stata acquisita utilizzando un'apparecchiatura SBP120 (frequenza; 12 kHz, angolo a fascio largo; 90–120°, Kongsberg).La mappa oceanica globale è stata generata con Ocean Data View versione 5.1.4 (GlobalHR, https://odv.awi.de).I dati sugli oligoelementi per carbonato (1 M AA percolati), solfuro (3 M HNO3 percolati), silicato detritico (digestione HF-HCl) e frazioni lipidiche sono riportati nelle tabelle S1–S4 nelle informazioni supplementari.Rispetto a JLs-1 (materiale di riferimento carbonatico; calcare triassico), le frazioni carbonatiche studiate in questo studio erano generalmente caratterizzate da abbondanze di oligoelementi molto più elevate (Fig. 2 e Fig. S3), molti dei quali (litio (Li), transizione metalli, stronzio (Sr), REE, piombo (Pb) e torio (Th)) sono stati arricchiti fino a poche centinaia di volte.Al contrario, tre elementi (titanio (Ti), bario (Ba) e W) hanno mostrato concentrazioni relativamente inferiori (esaurimento fino a dieci volte rispetto a JLs-1).Fattori di arricchimento di (a) dati sulla frazione carbonatica (1 M AA percolati) normalizzati ai valori per il materiale di riferimento carbonato JLs-1, (b) dati sulla frazione lipidica totale normalizzati ai valori per il materiale di riferimento carbonato JLs-1 e (c) dati sulla frazione lipidica totale normalizzati ai valori per le corrispondenti frazioni carbonatiche (1 M AA percolati).I dati sugli oligoelementi per le fasi solide ricche di solfuro estratte (cioè, percolati HNO3 3 M) sono stati normalizzati ai dati per le corrispondenti frazioni di carbonato, indicando che alcuni elementi (Ti, rame (Cu), zirconio (Zr) e Th) in le frazioni di carbonato e solfuro sono state arricchite da 10 a 100 volte (Fig. S3).Anche le abbondanze di oligoelementi nelle frazioni di silicato detritico sono state normalizzate ai valori di riferimento Post Archean Australian Shale (PAAS)28.Alcuni elementi, come Li, Rb (rubidio), Ba, W, Pb, Th e U, sono stati relativamente arricchiti nelle frazioni di silicato detritico rispetto al PAAS (Fig. S3).Per le frazioni lipidiche, diversi oligoelementi hanno mostrato un'ampia gamma di valori di abbondanza (Li: 2,8–29,9 ppm, metalli di transizione: 0,5–300 ppm, Rb: 2,2–4,1 ppm, Sr: 12,0–45,0 ppm, Ba: 13,0–22,0 ppm, tabelle S1–S4).Al contrario, i REE hanno mostrato abbondanze molto basse (< 1,34 ppm) nelle frazioni lipidiche.In particolare, i dati della frazione lipidica normalizzati a JLs-1 e le frazioni carbonatiche dei carbonati CB hanno mostrato chiaramente un marcato arricchimento di Ti, Ni, Cu, Zn e Pb (fino a 10-1000 volte; Fig. 2, vedi anche Fig. .S4).Le concentrazioni di lipidi arcaici e batterici hanno mostrato grandi variazioni nei carbonati autigeni CB (Fig. 3, vedi anche Tabella S5).Tra gli idrocarburi isoprenoidi, gli isoprenoidi irregolari da coda a coda, come il crocetano, sono spesso coeluiti con fitano.Considerando che le composizioni isotopiche dei picchi di crocetano/fitano nei carbonati CB erano comprese tra -28,5 e -25,4‰ (Tabella S5), cioè non impoverite di 13C, sembra che il crocetano fosse quasi assente nei nostri campioni, ma il fitano derivava dal la degradazione della clorofilla e di altri pigmenti era presente con valori di 0,01–0,05 μg g-1 peso secco (dw).Il composto C25 2,6,10,15,19-pentametilicosano (PMI) è stato rilevato nell'intervallo 0,02–0,04 μg g-1 dw.Inoltre, i dieteri isoprenoidi dialchilglicerolo (DGD isoprenoidi), come archeolo e sn-2-idrossiarcheolo, erano i lipidi arcaici più predominanti nei campioni, mostrando intervalli di concentrazione di 0,02–0,18 μg g-1 dw e 0,02–0,32 μg g- 1 dw, rispettivamente.Per i lipidi batterici, sono stati identificati DGD non isoprenoidi (cioè, If, IIa e IId) con porzioni anteiso pentadeciliche o gruppi ciclopropilici attaccati in entrambe le posizioni sn-1 e sn-2, comprese tra 0,01 e 0,11 μg g-1 dw .Rispetto ad altri DGD (serie I, II e III), non è stato possibile determinarne completamente la presenza a causa del limite di rilevamento.Tra gli acidi grassi (FA) rilevati, gli FA saturi (ad es. C16:0 e C18:0) erano i più predominanti, con un range compreso tra 0,04 e 0,62 μg g-1 dw (Tabella S5).Altri FA (ad es. i-C15:0, ai-C15:0, C16:1ω7, C18:1ω9, C18:1ω7, C20:0 e C22:0) avevano una concentrazione da 2 a 10 volte inferiore (0,01– 0,23 μg g- 1 dw) rispetto agli FA saturi predominanti (Tabella S5).I valori δ13C di PMI variavano da − 88,2 a − 61,5 ‰ (Fig. 3, vedere anche la Tabella S5).I valori δ13C di archeolo e sn-2-idrossiarcheolo variavano rispettivamente tra − 102,9 e − 82,9‰ e tra − 108,0 e − 87,5‰ (Fig. 3, vedere anche Tabella S5).Infine, i valori δ13C dei DGD non isoprenoidi variavano da -88,6 a -50,6‰ (Fig. 3, vedi anche Tabella S5).Firme dei biomarcatori lipidici dei carbonati autogeni del CB: (a) concentrazioni dei principali biomarcatori lipidici e rapporti di sn-2-idrossiarcheolo rispetto all'archeolo e (b) composizioni isotopiche del carbonio dei principali biomarcatori lipidici.Si noti che la linea tratteggiata indica il valore medio di δ13C di metano (δ13CCH4) mentre l'area ombreggiata mostra l'intera gamma di valori di δ13CCH4.I phyla arcaici rilevati nei campioni studiati erano Euryarchaeota, Lokiarchaeota, Bathyarchaeota e Thaumarchaeota (Tabella S6), con Euryarchaeota che aveva l'abbondanza più alta, rappresentando > 85% delle sequenze arcaiche totali.Tra questi, l'abbondanza relativa di archaea ASV032, che appartiene ad ANME-1, era dominante (fino al 99,5%; Fig. 4).Un altro archaea, ASV095, che appartiene a Methanosarcinales, comprendeva dallo 0,5% al ​​64,4% delle sequenze archeali.Nelle comunità batteriche erano predominanti Firmicutes, Proteobacteria, Atribacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes e WM88 (Tabella S6).Abbondanze relative di archaea taxa al phylum e livello di ordine di Euryarchaeota nei carbonati autogeni del Chukchi Borderland (CB).'nd' indica 'non determinato'.La calcite di magnesio (Mg) era il minerale più dominante (23-46% in peso) in tutti i campioni di carbonato recuperati dai cumuli di CB (Tabella 1).In generale, le condizioni ambientali durante le quali si verifica la precipitazione dei carbonati alle infiltrazioni fredde possono essere dedotte dalla composizione mineralogica dei carbonati23,29.Ad esempio, si ritiene che la precipitazione dell'aragonite sia favorita in condizioni sub-ossiche caratterizzate da elevate concentrazioni di solfato disciolto nelle acque interstiziali (cioè vicino al fondale marino), mentre calcite e dolomite ad alto Mg si formano preferibilmente in condizioni più riducenti e bassi livelli di solfato30.I minerali carbonatici contenenti Mg come la dolomite si trovano spesso in strati di sedimenti impoveriti di solfato sepolti in modo relativamente profondo31.Per analogia, i carbonati di Mg-calcite incontrati nei cumuli di CB molto probabilmente indicano precipitazioni in condizioni riducenti all'interno della colonna di sedimenti32.Inoltre, considerando che il solfuro disciolto può catalizzare la disidratazione degli ioni Mg2+ nei fluidi, consentendo una più rapida precipitazione delle Mg-calcite rispetto all'aragonite33, i cumuli di CB possono essere soggetti a condizioni anossiche per lunghi periodi di tempo, poiché i microambienti arricchiti di solfuro potrebbero avere stato modellato da processi AOM in condizioni anossiche.Inoltre, la precipitazione preferenziale della calcite rispetto all'aragonite può verificarsi a temperature relativamente basse34, dato che la temperatura nelle acque di fondo del mare di Chukchi è tipicamente inferiore a 1 °C21.Pertanto, queste proprietà potrebbero potenzialmente spiegare la predominanza della calcite sull'aragonite nei campioni di carbonato.I valori misurati di δ13Ccarb (da − 37,0 a −32,8‰; Tabella 1 e Fig. S2) erano significativamente inferiori ai valori tipici (~ 0‰) del bicarbonato marino (cioè, carbonio inorganico disciolto nell'acqua di mare)35.In generale, i valori di δ13Ccarb riflettono la fonte di carbonio disciolto incorporato durante la precipitazione del carbonato36.I potenziali contributi di queste diverse firme isotopiche del carbonio includono (1) metano (δ13CCH4 per origine biogenica; < -60‰ e δ13CCH4 per origine termogenica; da −50 a −30‰) e (2) materia organica (ca. − 25‰ )37,38.Inoltre, l'entità della deplezione di 13C nei carbonati può essere un indicatore di specifici processi microbici39,40.Considerando che la composizione isotopica del carbonio del metano ascendente (δ13CCH4; da −95,7 a −44,1‰) studiata nei cumuli di CB riflette una miscela di fonti biogene e termogeniche22, l'ossidazione microbica utilizzando questo metano ascendente può produrre bicarbonato impoverito di 13C (HCO3−) nei sedimenti.Non siamo riusciti a determinare l'età precisa dei campioni di carbonato utilizzando il metodo U-Th, a causa delle grandi quantità di Th detritico nei nostri campioni.Tuttavia, considerando le profondità di campionamento dei nostri campioni di carbonato (vedi Fig. S1), potrebbero essere debolmente correlati all'attuale zona di transizione solfato-metano (SMTZ).Pertanto, l'esaurimento isotopico di tutti i carbonati (δ13Ccarb < - 30‰) nei cumuli di CB suggerisce che una frazione sostanziale del carbonio coinvolto nella precipitazione dei carbonati fosse derivata dai fluidi ricchi di metano ascendenti, probabilmente correlati ad antichi rilasci di metano simili a quelli avvenuta nel Mare di Barents41.I fluidi dei pori si arricchiscono di 18O (δ18Ofluido) durante la disidratazione dei minerali argillosi o la dissociazione degli idrati di gas, il che si traduce in alti valori di δ18Ocarb30,42,43.Nel sito studiato, sono stati identificati strati di idrati di gas a profondità di sedimenti inferiori a 3–4 m22.A questo proposito, i carbonati dominati dalla calcite (δ18Ocarb; 5,1 ± 0,6‰ VPDB (n = 7), Tabella 1 e Fig. S2) studiati nei tumuli CB mostrano firme isotopiche arricchite con 18O.Pertanto, questi risultati possono indicare che sono precipitati da acque dei pori arricchite in modo simile, risultanti dalla dissociazione degli idrati di gas.Rispetto ai carbonati bioscheletrici marini (cioè, calcare JLs-1), la maggior parte degli oligoelementi nelle frazioni carbonatiche sono arricchiti nei carbonati di filtrazione fredda studiati, ad eccezione di Ti, Ba e W (Fig. 2a).Questi arricchimenti sono ben spiegati in quanto riflettono la composizione geochimica delle acque interstiziali circostanti, ereditata da vari processi diagenetici precoci che tipicamente si traducono in un arricchimento selettivo di oligoelementi44.Nelle infiltrazioni fredde, i carbonati autigenici dominati dalla calcite incorporano tipicamente quantità maggiori di oligoelementi (compresi i REE) rispetto ai campioni ricchi di aragonite, che si formano vicino al fondo del mare27.Inoltre, condizioni anossiche sostenute nelle infiltrazioni fredde generalmente spiegano perché molti oligoelementi redox-sensibili (Mo, U, Ni, V, Co e Zn) sono arricchiti in corrispondenti carbonati autigeni, come nei campioni di carbonato CB45.L'arricchimento di Mo si riferisce tipicamente al ciclo dell'ossiidrossido Fe-Mn nei sedimenti sotterranei e/o alla formazione di minerali di solfuro, risultante dalla presenza di idrogeno solforato nelle acque dei pori rilasciate dall'AOM46.Allo stesso modo, gli arricchimenti osservati identificati per Ni, Co e Zn riflettono la remineralizzazione della materia organica nei sedimenti sotterranei, che si traduce anche in acque porose sedimentarie arricchite47,48.Gli estratti lipidici totali dei carbonati CB hanno mostrato particolari arricchimenti di oligoelementi (Li, Ti, Ni, Co, Cu, Zn e Mo) rispetto alle corrispondenti frazioni di carbonato (Fig. 2c).Contrariamente agli arricchimenti osservati nelle frazioni carbonatiche lisciviate, che sono direttamente ereditate dalla composizione chimica delle acque interstiziali da cui sono precipitate, l'arricchimento associato alle frazioni lipidiche ospitate dai carbonati autigeni può fornire informazioni sugli elementi bioessenziali correlati all'attività microbica guidata da AOM a seeps20.Finora, Ni e Zn sono stati identificati nelle cellule dell'organismo microbico, specialmente negli assemblaggi microbici correlati all'infiltrazione, dove sono legati a siti specifici di proteine ​​ed enzimi49,50.Il co è presente nelle cobammidi coinvolte nel trasferimento del gruppo metilico durante la metanogenesi e nei processi metanotrofici17.Mo è legato a un cofattore pterinico per formare molibdopterina, che catalizza le reazioni redox degli elettroni50, mentre Zn si presenta come un singolo atomo strutturale in entrambi gli enzimi50 (p. es., l'enzima metanolo-coenzima M metiltransferasi (Mta) e l'eterodisolfuro reduttasi (Hdr)).Considerando che i metalloenzimi microbici svolgono un ruolo chiave nella catalizzazione delle principali reazioni biogeochimiche, in particolare AOM51, questi enzimi possono richiedere alcuni oligoelementi (ad es. Co, Ni, Mo e Zn) come cofattori per il trasporto di elettroni o come centri catalitici attivi siti50.Sebbene gli oligoelementi (soprattutto Cu e Ni) possano essere arricchiti nelle frazioni organiche (cioè lipidiche) a causa delle loro affinità chimicofisiche con la materia organica45, gli oligoelementi, come Co, Ni, Mo e Zn, sono stati arricchiti, non solo in le frazioni lipidiche (Fig. 2b) ma anche nelle frazioni carbonatiche (Fig. 2a).Quindi, è molto probabile che l'arricchimento di Co, Ni, Mo e Zn identificato nelle frazioni lipidiche totali associate ai carbonati CB rifletta la loro implicazione in specifici percorsi enzimatici ricchi di metalli correlati all'attività metanotrofica guidata dall'AOM.Il Fe è presente principalmente come cluster Fe-S utilizzati per il trasporto di elettroni e/o la catalisi, mentre Ni è legato ai cluster Fe-S o al centro di una porfirina unica per metanogeno/metanotrofi contenente il cofattore F43052.Pertanto, il loro arricchimento negli estratti lipidici totali separati dai carbonati CB potrebbe riflettere in modo simile il loro ruolo potenziale come fattore limitante per le attività metanotrofiche a causa della loro elevata biodisponibilità come metalloenzimi essenziali durante l'AOM53.Per quanto riguarda il Cu, anch'esso significativamente arricchito nelle frazioni lipidiche analizzate, vale la pena ricordare che gli enzimi metanotrofi anaerobici Cu-dipendenti non sono stati ancora identificati, sebbene la disponibilità di Cu sia importante per i metanotrofi aerobici54.Ad esempio, un aumento della concentrazione di Cu può causare un'espressione fino a 55 volte del particolato metano-monoossigenasi (pMMO) come proteina di membrana che si trova nei metanotrofi aerobici50.Arricchimenti simili sono stati recentemente documentati in infiltrazioni di freddo per elementi leggeri di terre rare (es. La, Ce), riflettendo anche la loro utilità preferenziale nell'attività metanotropica aerobica55.Nei carbonati CB, le frazioni lipidiche totali estratte non hanno mostrato alcun particolare arricchimento in REE leggero, indicando un disaccoppiamento tra Cu e REE leggero.Dato che i carbonati di Mg-calcite sono stati prevalentemente precipitati in condizioni anossiche nei cumuli di CB, gli arricchimenti di Cu osservati nei carbonati di CB non sarebbero associati alla metanotrofia aerobica.Pertanto, sono necessari ulteriori studi per valutare meglio la potenziale utilità del Cu nel trattamento dell'AOM.Allo stesso modo, deve ancora essere chiarito perché Li e Ti sono stati arricchiti nelle frazioni lipidiche studiate nei carbonati CB e se la potenziale biodisponibilità di Li e Ti come metalloenzimi potrebbe rappresentare un fattore limitante nella metanogenesi e nell'attività metanotrofica in condizioni anossiche.In particolare, questi elementi sono stati precedentemente identificati nelle cellule di microrganismi, specialmente negli assemblaggi microbici correlati all'infiltrazione, dove erano noti per essere legati a siti specifici di proteine ​​ed enzimi49,50.Pertanto, in una certa misura, ipotizziamo che gli arricchimenti di Cu, Li e Ti osservati nei lipidi totali dei carbonati CB potrebbero essere indicativi di processi microbici alternativi per l'AOM come metalloenzimi.Quindi, in molti aspetti fisiologici e biogeochimici, sono necessarie ulteriori ricerche per studiare la potenziale disponibilità di Cu, Li e Ti in metanogeni/metanotrofi anaerobici in colture pure.In questo studio, idrocarburi irregolari (p. es., PMI) e DGD isoprenoidi (p. es., archeolo e sn-2-idrossiarcheolo) sono stati identificati come lipidi correlati all'AOM, mostrando la predominanza di DGD isoprenoidi nella maggior parte dei campioni di carbonato CB (Fig. 3).La composizione δ13C di questi lipidi indicava firme relativamente impoverite di 13C, rispetto a quelle riportate per il metano nei cumuli di CB (Fig. 3).In generale, i lipidi microbici derivati ​​dal metano sono esauriti in 13°C rispetto alla fonte di metano a causa del frazionamento isotopico durante l'assimilazione del metano56.I DGD isoprenoidi più impoveriti di 13C (cioè archeolo e sn-2-idrossiarcheolo) possono indicare la presenza di metanotrofi coinvolti nell'AOM.In particolare, CB-6 ha mostrato i DGD isoprenoidi impoveriti di 13C più predominanti.Questo modello impoverito di 13C potrebbe essere strettamente collegato all'AOM attiva che si verifica negli strati di sedimenti in cui si trova attualmente l'SMTZ22 (profondità del sedimento di 90–120 cm).D'altra parte, poiché la profondità dell'SMTZ nelle infiltrazioni di metano può fluttuare a causa dei flussi di metano verso l'alto57,58, basse quantità di lipidi impoveriti di 13C studiate in altri campioni di carbonato CB potrebbero in alternativa essere spiegate come risultato della diffusione migrazione di fluidi ricchi di metano59.In questo contesto, la bassa quantità di lipidi microbici impoveriti di 13C nei carbonati CB al di sotto e al di sopra dell'attuale SMTZ potrebbe potenzialmente riflettere le deboli attività AOM come segno fossile durante il cambiamento nei flussi di metano60.Nei carbonati CB studiati sono stati rilevati anche DGD non isoprenoidi (If, IIa e IId) derivati ​​da SRB61,62 termofili e alofili (Fig. 3).Nel complesso, l'abbondanza di lipidi batterici nei carbonati CB era inferiore a quella dei lipidi arcaici correlati all'AOM.Considerando studi precedenti in altre infiltrazioni di freddo, come il Mare del Nord63 e il Mar Mediterraneo orientale64, il pattern osservato tra entrambi i gruppi lipidici sembra riflettere il processo di riduzione del solfato accoppiato all'AOM.Inoltre, questi lipidi batterici sono più arricchiti in 13C rispetto ai lipidi arcaici (∆13C = 10–15‰), il che riflette il loro coinvolgimento nell'AOM come partner sintrofici7,65.Sulla base di questi frazionamenti isotopici, i DGD non isoprenoidi impoveriti di 13C nei carbonati CB (CB-1, -2, -6 e -7) possono servire come prova di organismi sintrofici coinvolti nell'AOM.Tuttavia, i valori δ13C dei DGD non isoprenoidi (− 53,9 ± 3,6‰, n = 5) in altri carbonati CB (CB-3, -4 e -5) sono stati leggermente arricchiti in 13C rispetto al metano ascendente riportato in i tumuli CB.Pertanto, questi lipidi arricchiti con 13C possono indicare che questi composti provengono da una fonte mista che media l'AOM così come altri processi.I nostri risultati dovrebbero essere ulteriormente confermati determinando le proprietà quantitative e qualitative degli organismi sorgente ottenuti da diversi approcci analitici, come l'idrolisi dell'idrossido di potassio (KOH).Sulla base dei lipidi microbici e degli acidi nucleici, è possibile determinare la chemiotassonomia dei microbi chiave coinvolti nell'AOM66.Tre gruppi di ANME (ANME-1, ANME-2 e ANME-3) sono stati spesso segnalati in vari ambienti di filtrazione fredda, che sono correlati a metanogeni dell'ordine Methanosarcinales e Methanomicrobiales58,67.Le comunità microbiche dominate da ANME-1 biosintetizzano archeolo e PMI con quantità relativamente basse di pentametilicoseni (PME), mentre ANME-2 è caratterizzata dalla predominanza di sn-2-idrossiarcheolo (rispetto all'archeolo) e abbondanti PME e crocetane/crocetene66.Insieme alla presenza di PMI nei carbonati CB, il rapporto tra sn-2-idrossiarcheolo e archeolo variava nell'intervallo 0,9-1,8 (Fig. 3), suggerendo la presenza dominante di ANME-1, che viveva in condizioni anaerobicamente impoverite di solfato68 .Questi pattern lipidici distintivi nella maggior parte dei carbonati CB erano supportati anche da proporzioni più elevate di ASV032, che appartiene ad ANME-1 (Fig. 4).Inoltre, la co-occorrenza di partner batterici sintrofici associati ad ANME-1 può essere indirettamente dedotta dall'abbondanza di lipidi batterici, come DGD non isoprenoidi e acidi grassi66.Ad oggi, i DGD non isoprenoidi impoveriti di 13C sono stati trovati principalmente in importanti sistemi ANME-166.Pertanto, i DGD non isoprenoidi meno impoveriti di 13C nei carbonati CB sembrano essere associati a un SRB sconosciuto collegato all'AOM69.Inoltre, la bassa abbondanza di acidi grassi ramificati (es. i-C15:0 e ai-C15:0) nei carbonati CB può anche indicare una presenza trascurabile di tipici SRB (es. Desulfosarcina/Desulfococco) associati ad ANME-1.Questa inferenza può essere parzialmente supportata dalla sequenza incompleta di Deltaproteobacteria.Quindi, queste caratteristiche lipidiche nei carbonati CB, in combinazione con i dati di pirosequenziamento del gene 16S rRNA, suggeriscono che gli SRB, non appartenenti ai Deltaproteobatteri ma forse ad altre comunità batteriche, sarebbero stati coinvolti nell'AOM nei cumuli di CB.In particolare, è stato dimostrato al microscopio che ANME-1 si presenta come una singola cellula in ambienti di filtrazione fredda70.Di conseguenza, le relazioni sintrofiche correlate all'ANME-1 all'interno dei cumuli di CB sembrano essere più legate ad altre comunità batteriche rispetto ai tipici consorzi SRB.Per studiare ulteriormente i modelli di distribuzione degli oligoelementi (W, Li, Ti, Ni, Co, Cu, Zn e Mo) che presumibilmente agiscono come potenziali metalloenzimi coinvolti nell'AOM a infiltrazioni fredde, è stata eseguita l'analisi dei componenti principali (PCA) utilizzando i dati per estratti lipidici totali normalizzati a JLs-1 (Fig. 5a).Abbiamo utilizzato questi dati per confrontare campioni di carbonato autogenico raccolti da diverse regioni del mondo invece di quelli normalizzati alle frazioni di carbonato associate (Fig. S5).Sebbene W non sia stato rilevato nei nostri campioni lipidici totali del CB, questo elemento è incluso perché pronunciate anomalie di W legate ai lipidi sono riportate in altri siti di filtrazione in tutto il mondo20.La PCA è stata anche eseguita utilizzando i dati dei lipidi arcaici e batterici per confrontare le firme CB con quelle di altre infiltrazioni fredde20 (Fig. 5b-c).I risultati della PCA mostrano che la distribuzione combinata di oligoelementi e lipidi batterici nei carbonati CB differisce da quella riportata per altre infiltrazioni di metano in tutto il mondo (ad es. Congo fan; CF, Nile deep-sea fan; NDSF, Niger fan; NF e Golfo di Messico; GoM).Questa scoperta suggerisce che l'arricchimento di Ni, Co, Zn, Cu, Ti e Mo nelle frazioni lipidiche ospitate dal carbonato potrebbe essere potenzialmente correlato a diverse comunità metanotrofiche e ai loro metalloenzimi.Questa ipotesi è plausibile perché ANME-1 è predominante nei carbonati CB, mentre ANME-1 e Methanosarcinales (potenziale ANME-2) coesistono in altri siti20 (Figg. 6, 7).Il metil-coenzima MCR contenente Ni è l'enzima chiave in AOM19.Due diversi omologhi MCR, designati come proteine ​​I e II71,72 sono stati isolati da aree di filtrazione fredda: la proteina I contiene (172S)-172-metiltio-F430, mentre la proteina II contiene F43018,73.Considerando che la proteina I è rilevata prevalentemente in ANME-174, si può dedurre che particolari condizioni ambientali (es. temperatura e pressione parziale del metano) nell'area del tumulo CB promuovono specificamente la sintesi della proteina I per AOM75 rispetto a quanto si può osservare a altri siti di infiltrazione.Sono necessari studi futuri mirati a sorgenti di fluidi gassosi in profondità e alla litologia del sottosuolo per svelare i fattori cruciali per determinare le attività discriminatorie dell'ANME coinvolte nella risposta stimolata durante la dissociazione del permafrost.L'impatto della degradazione dei lipidi/enzimi sulle correlazioni tra i lipidi e gli oligoelementi correlati all'AOM dovrebbe anche essere testato confrontando le loro relazioni utilizzando i dati di campioni di carbonato moderni e antichi.Precedenti studi hanno dimostrato che esiste una significativa differenza di arricchimento degli oligoelementi tra le estrazioni lipidiche intra e intercristalline nei carbonati di filtrazione48.Pertanto, gli studi futuri dovrebbero anche esplorare l'effetto della procedura di estrazione in due fasi sulle distribuzioni degli oligoelementi.Risultati PCA per (a) i dati di tracce metalliche per i lipidi totali normalizzati ai valori del materiale di riferimento carbonato JLs-1 e per i dati di concentrazione di (b) lipidi arcaici e (c) lipidi batterici.Confronto delle firme dei biomarcatori lipidici di carbonati autogeni da CB, conoide del Congo (CF), conoide del Nilo (NDSF), conoide del Niger (NF) e Golfo del Messico (GoM): (a) concentrazioni dei principali biomarcatori lipidici e rapporti di sn-2-idrossiarcheolo rispetto all'archeolo e (b) composizioni isotopiche del carbonio dei principali biomarcatori lipidici con quelle dei carbonati.Albero filogenetico delle sequenze di rDNA arcaico ottenute da carbonati autogeni.Abbiamo analizzato una serie di campioni di carbonato autogenico raccolti a infiltrazioni di metano dal versante sud-occidentale del CB utilizzando vari proxy inorganici e organici di fonti di fluidi e processi biogeochimici (isotopi stabili, mineralogia, oligoelementi, biomarcatori lipidici e acidi nucleici).L'assenza di crocetano, l'abbondanza di PMI e il rapporto relativamente basso tra sn-2-idrossiarcheolo e archeolo nei carbonati CB indicavano la presenza dominante di ANME-1, come confermato dal pirosequenziamento del gene 16S rRNA.Specifici oligoelementi (Ni, Co, Zn, Cu, Ti e Mo) sembravano essere arricchiti nelle frazioni lipidiche totali estratte dai carbonati CB, confermando recenti scoperte sulla loro utilità come metalloenzimi nei processi microbici correlati all'AOM a infiltrazioni fredde.I modelli di arricchimento di oligoelementi e assemblaggi lipidici microbici nei carbonati CB rivelano caratteristiche specifiche distinte rispetto a quelle di altre infiltrazioni in tutto il mondo (ad esempio, conoide del Congo, conoide del Nilo, conoide del Niger e Golfo del Messico).int.Sci.Articolo ADS CAS Google ScholarSci.Sci.Articolo ADS CAS Google ScholarSono.soc.Sci.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS PubMed Google ScholarArticolo CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarSci.ris.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google Scholarris.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarSci.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google Scholarsoc.Sono.Articolo ADS CAS Google Scholarris.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google Scholarsoc.Sono.Articolo ADS CAS Google Scholarris.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo CAS PubMed Google ScholarSono.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS PubMed Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarArticolo CAS PubMed Google ScholarSci.Articolo CAS PubMed Google Scholarint.Articolo ADS CAS Google 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